Visfatin mRNA表达的建立
安徽医科大学第一附属医院内分泌科 邮编230022
王长江  林 刚  代 芳  葛宏华  贾敬华

目的 构建人Visfatin重组表达载体并稳定转染到3T3-LI细胞，并探讨TNF-a、吡格列酮对3T3-L1细胞中稳定转染人Visfatin mRNA表达的影响。
方法 以人脑cDNA文库为模板进行PCR扩增hVisfatin的全长cDNA并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建出pcDNA3.1(+)/hVisfatin表达载体，经核苷酸序列分析证实。脂质体法转染3T3-L1细胞，G418筛选，RT-PCR法鉴定。用TNF-a（10 ng/ml）、吡格列酮(100 nmol/ml)分别处理稳定转染人Visfatin 3T3-L1细胞，设置同期无干预3T3-L1细胞作对照，24h后半定量RT-PCR法检测hVisfatin mRNA的表达水平。
结果 ○1重组真核表达质粒经限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切后获得5.4kb和1.5kb两个片断，大小与理论值一致，并由核苷酸序列测定证实。在重组真核表达质粒转染的3T3-L1细胞中抽提RNA，经RT-PCR法扩增出1.5kb目的片断，而空载质粒转染细胞未扩增出此目的片断。○2稳定转染3T3-L1细胞已分化较未分化者hVisfatin mRNA表达水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)。稳定转染3T3-L1细胞已分化和未分化者经TNF-a 作用后hVisfatin mRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。 稳定转染3T3-L1细胞已分化和未分化者经吡格列酮作用后hVisfatin mRNA表达水平无显著性差异(P>0.05)。
结论 成功构建人Visfatin重组表达载体及其稳定表达细胞系；在稳定转染的3T3-L1细胞中，hVisfatin mRNA表达水平可能与脂肪细胞分化有关；TNF-a抑制hVisfatin mRNA表达而吡格列酮对hVisfatin mRNA表达无明显影响。
关键词  visfatin  转染  3T3-L1细胞  肿瘤坏死因子-a  吡格列酮